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实验2 高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因
(2017/07/18 14:38:39)

一、实验目的

通过用高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因,掌握采用高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。

二、方法原理

定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其它组分(如单宁酸、咖啡酸、蔗糖等)分离后,将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液也进入色谱系统。如流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的,测定它们在色谱图上的保留时间tR(或保留距离)和峰面积A后,可直接用tR定性,用峰面积作为定量测定的参数,采用工作曲线法(即外标法)测定饮料中的咖啡因含量。

三、仪器设备与试剂材料

1.高效液相色谱仪,UV254nm)检测器。

2.色谱柱:ODS(n-C18)柱。

3.超声波发生器或水泵。

4.微量注射器:50μL

5.咖啡因标准试剂;待测饮料试液。

6.流动相:20%甲醇+80%水,1L;制备前,先调节水的pH3.5,进入色谱系统前,用超声波发生器或水泵脱气5min

四、实验步骤

1.标准贮备液的配制:准确称取25.0mg咖啡因标准试剂,用配制的流动相溶解,转入100mL容量瓶中,稀释至刻度。

2.用标准贮备液配制浓度分别为25μg∙mL-1, 50μg∙mL-1, 75μg∙mL-1, 100μg∙mL-1, 125μg∙mL-1的系列标准溶液。

3.启动泵,打开检测器,设置泵的流速为2.3mL∙min-1,检测器的灵敏度设在0.08AUFS,打开记录仪,将纸速设在1cm∙min-1。当流动相通过色谱柱约510min,记录仪上基线稳定后,开始进样。

4.将进样阀放在装载(LOAD)位时,用注射器取25μL浓度最低的标准样(比进样阀上定量管多5μL以上),注入进样阀中。

5.将进样阀从装载(LOAD)位转向进样(INJECT)位,同时按标记钮(MARKER),使在记录纸上打上进样信号。

6.当咖啡因的色谱峰出完后,按照步骤45连续操作2次,使最低浓度的标准试液获得3张色谱图。

7.按标准溶液浓度增加的顺序,按步骤46操作,使每一种标准样获得3个数据。

8.取2mL咖啡饮料试液放入25mL容量瓶中(或取5mL茶液放入50mL容量瓶中),分别用流动相稀释至刻度。

9.按步骤46操作,分析饮料试液(咖啡或茶)。

五、数据处理

1.用长度表示保留时间(保留距离),测定标样色谱。图上进样信号与色谱峰极大值之间的距离。

2.根据标准试样色谱图中的保留数据,找到并标出咖啡或茶样色谱图中相应咖啡因色谱峰。

3.用A=hY1/2公式计算每一张色谱图上的峰面积,并对每一个样品求出平均值。

4.用系列标准溶液的数据作面积A对质量浓度ρ(mg∙mL-1)的工作曲线。

5.从工作曲线上求得咖啡或茶中咖啡因的质量浓度(mg∙mL-1)。(注意步骤9的稀释)。

六、问题讨论

1.解释用反相柱n-C18测定咖啡的理论基础。

2.在本实验中,用峰高h为定量基础的校正曲线能否得到咖啡因的精确结果?

3.能否用离子交换柱测定咖啡因?为什么?

 

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