一、实验目的

通过用高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因，掌握采用高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。

二、方法原理

定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其它组分（如单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液也进入色谱系统。如流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间t_R（或保留距离）和峰面积A后，可直接用t_R定性，用峰面积作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。

三、仪器设备与试剂材料

1．高效液相色谱仪，UV（254nm）检测器。

2．色谱柱：ODS(n-C₁₈)柱。

3．超声波发生器或水泵。

4．微量注射器：50μL。

5．咖啡因标准试剂；待测饮料试液。

6．流动相：20%甲醇＋80%水，1L；制备前，先调节水的pH≈3.5，进入色谱系统前，用超声波发生器或水泵脱气5min。

四、实验步骤

1．标准贮备液的配制：准确称取25.0mg咖啡因标准试剂，用配制的流动相溶解，转入100mL容量瓶中，稀释至刻度。

2．用标准贮备液配制浓度分别为25μg∙mL^-1, 50μg∙mL^-1, 75μg∙mL^-1, 100μg∙mL^-1, 125μg∙mL^-1的系列标准溶液。

3．启动泵，打开检测器，设置泵的流速为2.3mL∙min^-1，检测器的灵敏度设在0.08AUFS，打开记录仪，将纸速设在1cm∙min^-1。当流动相通过色谱柱约5～10min，记录仪上基线稳定后，开始进样。

4．将进样阀放在装载（LOAD）位时，用注射器取25μL浓度最低的标准样（比进样阀上定量管多5μL以上），注入进样阀中。

5．将进样阀从装载（LOAD）位转向进样（INJECT）位，同时按标记钮（MARKER），使在记录纸上打上进样信号。

6．当咖啡因的色谱峰出完后，按照步骤4～5连续操作2次，使最低浓度的标准试液获得3张色谱图。

7．按标准溶液浓度增加的顺序，按步骤4～6操作，使每一种标准样获得3个数据。

8．取2mL咖啡饮料试液放入25mL容量瓶中（或取5mL茶液放入50mL容量瓶中），分别用流动相稀释至刻度。

9．按步骤4～6操作，分析饮料试液（咖啡或茶）。

五、数据处理

1．用长度表示保留时间（保留距离），测定标样色谱。图上进样信号与色谱峰极大值之间的距离。

2．根据标准试样色谱图中的保留数据，找到并标出咖啡或茶样色谱图中相应咖啡因色谱峰。

3．用A=hY_1/2公式计算每一张色谱图上的峰面积，并对每一个样品求出平均值。

4．用系列标准溶液的数据作面积A对质量浓度ρ(mg∙mL^-1)的工作曲线。

5．从工作曲线上求得咖啡或茶中咖啡因的质量浓度(mg∙mL^-1)。（注意步骤9的稀释）。

六、问题讨论

1．解释用反相柱n-C₁₈测定咖啡的理论基础。

2．在本实验中，用峰高h为定量基础的校正曲线能否得到咖啡因的精确结果？

3．能否用离子交换柱测定咖啡因？为什么？