一、实验目的
1．学习高效液相色谱仪的操作；
2．了解反相液相色谱法分离非极性化合物的基本原理；
3．掌握用反相液相色谱法分离芳香烃类化合物。
二、方法原理
高效液相色谱法选用颗粒很细的高效固定相，采用高压泵输送流动相，分离、定性及定量全部分析过程都通过仪器来完成。除了有快速、高效的特点外，它能分离沸点高、分子量大、热稳定性差的试样。
根据使用的固定相及分离机理不同，一般将高效液相色谱法分为分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱和空间排斥色谱等。
在分配色谱中，组分在色谱柱上的保留程度取决于它们在固定相和流动相之间的分配系数K：
显然，K越大，组分在固定相上的停留时间越长，固定相与流动相间的极性差值也越大。因此，相应出现了流动相为非极性而固定相为极性物质的正相液相色谱法和以流动相为极性而固定相为非极性物质的反相液相色谱法。目前应用最广泛的固定相是通过化学反应的方法将固定液键合到硅胶表面上，即所谓的键合固定相。若将正构烷烃等非极性物质（如n-C18）键合到硅胶基质上，以极性溶剂（如甲醇和水）为流动相，则可分离非极性或弱极性的化合物。据此，采用反相液相色谱法可分离烷基苯类化合物。
三、仪器设备与试剂材料
1．高效液相色谱仪；UV（254nm）检测器；色谱柱：250mm×4.6mm，n-C18柱。
2．流动相：80%甲醇＋20%水（使用前超声波脱气）。
3．微量注射器：10μL。
4．苯、甲苯、n-丙基苯，n-丁基苯（均为A.R.）。
5．未知样品。
四、实验步骤
1．用流动相溶液（80%甲醇＋20%水）配制浓度为10mg∙mL-1的标准样品。
2．在教师指导下，按下述色谱条件操作色谱仪。
柱温：室温；
流动相流速：1.3mL∙min-1；
UV检测器灵敏度：0.32～0.64AUFS。
3．待记录仪基线稳定后，分别进苯、甲苯、n-丙基苯，n-丁基苯标准样各5μL；进样同时，按标记钮（MARKER）（如为计算机软件控制，点击工作站软件相应记录按钮即可）。
4．获得四种标准样的色谱图后，按步骤3进未知试样20μL，记录色谱图。
五、数据处理
1．测定每一个标准样的保留距离（进样标记至色谱峰顶间的距离）。
2．测定未知试样中每一个峰的保留距离，与标准样色谱图比较，标出未知试样中每一个峰代表什么化合物。
3．用标样峰的峰面积，估算未知试样中相应化合物的含量。
六、问题讨论
1．解释未知试样中各组分的洗脱顺序。
2．试说明苯甲酸在本实验的色谱柱上，是强保留还是弱保留？为什么？
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